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二代测序结果有必要用一代测序验证吗?

来源:康百得生物2016-05-26

二代测序(NGS)数据可用于临床处理和研究。NGS所得到的DNA序列突变结果通常会反馈给病人/受试者,可作为临床或研究方案的一部分。目前处理的标准流程是用Sanger测序法对NGS突变数据进行验证,但Sanger测序法不仅成本高昂而且花费时间。

究竟有无必要用Sanger法对NGS数据进行验证?为此,作者利用ClinSeq 项目提供的NGS突变数据,大规模系统地评价了基于Sanger测序法的验证效果。首先,选取了来自5位受试者19个基因的NGS数据,以及同样样本的高通量Sanger法测序数据;两组数据的比较分析结果显示:在234NSG突变数据中,并未发现两者之间存在区别。然后,又分析比较了来自684位受试者5个基因的NGS突变数据与Sanger测序结果的差异性。结果显示,在超过5800NGS来源的突变中,仅有19个未得到Sanger法数据确认。用新设计的测序引物再次进行Sanger测序,确认了NGS突变中的17个,而剩余2个突变的外显组测序质量分数较低。总体上,Sanger测序对NGS突变数据的确认率达到99.965%,这已高于许多现有的无需正交验证的临床检验项目。

作者认为,单纯一次Sanger测序验证更可能错误地否定来自NGS的真阳性突变,而非正确地识别来自NGS的假阳性突变。因此,用Sanger测序验证来源于NGS的突变数据,实用价值有限。同时,最佳实施标准也不应当包括对NGS变异数据的常规正交Sanger法验证。

 

来源:Beck TF, Mullikin JC, NISC. Comparative Sequencing Program and Biesecker LG.Systematic Evaluation of Sanger Validation of Next-Generation Sequencing Variants.Clin Chem. 201662(4):647-54.