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【口蹄疫试剂】口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒

发布时间:2017-08-10 15:49:14 来源:口蹄疫试剂 浏览次数:

 

口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒
【产品名称】
通用名称:口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒
英文名称:Foot-and-mouth disease virusFMDVreal-time RT-PCR Test Kit
【包装规格】10/
【预期用途】
口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒,采用实时荧光反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR )技术检测疑似感染动物的水疱皮或水疱液中所有血清型的FMDV,适用于FMDV的检测、诊断和流行病学调查。
【检测原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板,在反转录酶的作用下,以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链;然后在DNA 聚合酶的作用下,经高温变性、低温延伸的多次循环,使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。经荧光素标记的探针与扩增的DNA杂交,利用DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性,使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离,发出特异性荧光信号;利用荧光PCR仪检测特异性荧光信号,并根据样品Ct值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。
【主要组成成份】
大盒
(室温保存)
序号
名称
规格(10T
序号
名称
规格(10T
1
裂解液
8mL
5
洗脱液
1mL
2
BME
85μL
6
吸附柱和收集管
12
3
异丙醇
8mL
7
8PCR反应管
2
4
洗涤液
15mL
 
 
 
小盒
-20℃保存)
8
阴性对照
0.5mL
10
RT-PCR 反应液A
265μL
9
阳性对照
0.5mL
11
RT-PCR 反应液B
19μL
【储存条件及有效期】
储存条件详见【主要组成成份】,本试剂盒有效期为6个月。
【适用仪器及材料】
1. 设备:分析天平、离心机(12000/分钟)、荧光PCR仪、-20℃冰箱。
2. 器材:眼科剪、眼科镊、组织研磨器(研钵或匀浆器)、一次性注射器、可调移液器(2.5μL20μL200 μL1000 μL)、计时器。
3. 耗材及试剂:生理盐水、无RNA酶的1.5 mL离心管和吸头(10μL200 μL1000 μL)、灭菌蒸馏水。
【样品要求】
1.病死或扑杀的偶蹄动物,取溃烂或溃疡的表皮组织等。
2.待检的活动物,取水疱皮或水疱液置于50%甘油生理盐水中。
3.新鲜样品立即检测或短期内28 ℃保存,避免反复冻融。
【检验方法】
     一、样品制备
1.组织样品的处理:每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g,用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
2.水疱液的处理:取200 μL1.5 mL 灭菌离心管中。
3.阳性对照的处理:混匀后,取200 μL1.5 mL 灭菌离心管中。
4.阴性对照的处理:混匀后,取200 μL1.5 mL 灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 往裂解液中加入BME 77.6μL,充分混匀。(加入了BME的裂解液须置于4℃保存)
2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入600μL裂解液,上下颠倒混匀810次,室温静置10min
3. 加入600μL异丙醇,上下颠倒混匀5次。
4. 吸取650μL混合液转入吸附柱,12,000 rpm 离心45s,弃去收集管中液体,套回收集管。
5. 重复步骤4
6. 向吸附柱中加入600μL洗涤液,12,000 rpm 离心45s,弃去收集管中液体,套回收集管。
7. 重复步骤6
8. 空柱12,000 rpm 离心2 min
9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中,在吸附柱膜中央加入25μL洗脱液,室温静置1min12,000 rpm 离心45s,获得总RNA。立即检测或-20℃保存。
三、实时荧光RT-PCR
1. 反应体系配制:每份总体积25 µL,按下表配制,充分混匀,并作好标记。
试剂
用量
RT-PCR反应液A
21µL
RT-PCR反应液B
1.5µL
模板RNA
2.5µL
2. 反应程序:在荧光 PCR 仪上进行以下反应:42 15 min95 3min;循环 95 5 s58 40 s,共 40 次,在每次循环第二步(58 40s)收集 FAM 荧光信号(报告基团“FAM”,淬灭基团“None”)。
【参考值】阳性对照 Ct 值≤30.0 且出现典型扩增曲线,阴性对照无Ct值或Ct=40时,实验成立。
【检验结果的解释】
1 结果分析条件设定
阈值设定原则:阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
2 结果描述及判定
当被检样品出现典型的扩增曲线且 Ct 值≤30.0 时为口蹄疫病毒阳性,无 Ct 值为口蹄疫病毒阴性;对于 Ct 值>30.0 的样品,应重检,Ct 值>38.0 的样品判为阴性,Ct 值≤38.0 的样品判为阳性。
【注意事项】
1.各试剂须在规定的温度储存。
2.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期的试剂。
3. 严格遵守说明书操作,可以获得最好的实验结果,移液、定时等全部过程必须精确。
4.保存于-20℃的试剂使用前须完全融化,并充分混匀,8000rpm离心15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取,使用后立即放回-20℃
5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度,建议3次内用完。
6.注意防止试剂盒组份受污染,不同试剂盒之间的组份不要混用。
7RNA提取过程中,须戴口罩、勤换手套,尽量缩短操作时间,避免RNA酶污染。
8. BME含有对人体有害的物质,室温下避光保存,且避免直接接触。
 
 
提示:本文件内容及相关参数如有变更,恕不另行通知。我公司保留在不另行通知的情况下,对其中所包含内容进行更改的权利。具体操作须以产品内说明书为准。
 

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