
检测试剂
服务中心
深圳市康百得生物科技有限公司
电话:+86-755-26650513
+86-13602675831
传真:+86-755-26650520
地址:中国广东省深圳市南山区南油
天安工业区3栋4楼B单元
【禽流感H7试剂】禽流感病毒H7亚型RT-PCR 检测试剂盒
禽流感病毒H7亚型RT-PCR 检测试剂盒
【产品名称】
通用名称:禽流感病毒H7亚型RT-PCR 检测试剂盒
英文名称:Avian Influenza Virus serotype H7(AIV-H7)RT-PCR Test Kit
【包装规格】10份/盒、40份/盒
【预期用途】
本试剂盒采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR )技术检测禽组织、分泌物和排泄物中的AIV-H7,适用于AIV-H7的检测、诊断和流行病学调查。
【检测原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板,在反转录酶的作用下,以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链;然后在DNA 聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环,使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后,在紫外灯下,肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【主要组成成份】
大盒
(室温保存)
|
序号
|
名称
|
规格(10T/40T)
|
序号
|
名称
|
规格(10T/40T)
|
1
|
裂解液
|
8/30mL
|
6
|
吸附柱和收集管
|
12/42套
|
|
2
|
BME
|
85/400μL
|
7
|
0.2 mL 薄壁PCR 管
|
15/50个
|
|
3
|
异丙醇
|
8/30mL
|
8
|
50倍TAE电泳缓冲液
|
20/50mL
|
|
4
|
洗涤液
|
15/52mL
|
9
|
染色液
|
20/40μL
|
|
5
|
洗脱液
|
1mL/1mL×2
|
|
|
|
|
小盒
(-20℃保存)
|
10
|
RT-PCR 反应液A
|
220/362μL×2
|
13
|
阳性对照
|
0.5/1mL
|
11
|
RT-PCR 反应液B
|
16/52μL
|
14
|
阳性模板添加液
|
5/10μL
|
|
12
|
阴性对照
|
0.5/1mL
|
|
|
|
【储存条件及有效期】
储存条件详见【主要组成成份】,本试剂盒有效期为6个月。
【适用仪器及材料】
1. 设备:分析天平、离心机(12000转/分钟)、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、-20℃冰箱。
2. 器材:眼科剪、眼科镊、组织研磨器(研钵或匀浆器)、一次性注射器、可调移液器(2.5μL、20μL、200 μL、1000 μL)、1000mL 量筒、250 mL锥形瓶、计时器。
3. 耗材及试剂:生理盐水、琼脂糖、DNA Marker、无RNA酶的1.5 mL离心管和吸头(10μL、200 μL、1000 μL)、灭菌蒸馏水。
【样品要求】
1.病死或扑杀的禽,取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织。
2.待检活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,置于1mL 50%甘油生理盐水中。
3.新鲜样品立即检测或短期内2~8 ℃保存,避免反复冻融。
【检验方法】
样品制备
组织样品的处理:每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g,用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
呼吸道分泌物或排泄物的处理:用涡旋振荡器振荡30s,取200μL上清于1.5mL灭菌离心管中。
阳性对照的处理:混匀后,取200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。
阴性对照的处理:混匀后,取200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 往裂解液中加入BME 77.6μL(10T)或291μL(40T),充分混匀。(加入了BME的裂解液须置于4℃保存)
2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入600μL裂解液,上下颠倒混匀8~10次,室温静置10min 。
3. 加入600μL异丙醇,上下颠倒混匀5次。
4. 吸取650μL混合液转入吸附柱,12,000 rpm 离心45s,弃去收集管中液体,套回收集管。
5. 重复步骤4。
6. 向吸附柱中加入600μL洗涤液,12,000 rpm 离心45s,弃去收集管中液体,套回收集管。
7. 重复步骤6。
8. 空柱12,000 rpm 离心2 min。
9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中,在吸附柱膜中央加入25μL洗脱液,室温静置1min,12,000 rpm 离心45s,获得总RNA。立即检测或-20℃保存。
三、RT-PCR
1. 反应体系配制:每份总体积20 μL,分别取16.8μL RT-PCR反应液A(用前混匀)、1.2μL RT-PCR反应液B和2μL模板RNA(阳性对照管分别加入1μL模板RNA和1μL阳性模板添加液),混匀。最后加入20μL矿物油覆盖(有热盖的PCR仪不用加矿物油),作好标记。
2. 反应程序:在PCR仪上运行以下程序:42 ℃ 45 min,95℃ 3 min ;循环95 ℃ 30 s 、55℃ 40 s 、72 ℃ 40 s ,共35次;72 ℃延伸10 min。
四、电泳
1. 量取20mL 50倍TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至1000mL。
2. 称取1.5g琼脂糖放于250mL的锥形瓶中,加入100mL稀释好的TAE电泳缓冲液,微波炉加热溶解,稍稍冷却后加入10μL染色液混匀,倒入插有梳子的制胶板中。
(注意:染色液如已成干粉,可用20μL(10T)或40μL(40T)稀释好的TAE电泳缓冲液复溶。)
3. 待胶凝固后,上样孔端放在电泳槽负极。取10μL PCR产物点样于上样孔中,同时点DNA Marker作为参照,以90~120V的电压于稀释好的TAE电泳缓冲液中电泳,待溴酚兰指示剂电泳至凝胶中下部时结束电泳,在紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)上观察结果。
【参考值】阳性对照出现640bp扩增带,阴性对照在目标位置无带出现时,实验结果成立。
【检验结果的解释】被检样品出现640bp扩增带为禽流感病毒H7亚型阳性,否则为阴性。
【检验方法的局限性】本试剂盒仅用于定性检测。
【注意事项】
1.各试剂须在规定的温度储存。
2.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期的试剂。
3. 严格遵守说明书操作,可以获得最好的实验结果,移液、定时等全部过程必须精确。
4.保存于-20℃的试剂使用前须完全融化,并充分混匀,8000rpm离心15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取,使用后立即放回-20℃。
5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度,建议3次内用完。
6.注意防止试剂盒组份受污染,不同试剂盒之间的组份不要混用。
7.RNA提取过程中,须戴口罩、勤换手套,尽量缩短操作时间,避免RNA酶污染。
8. BME和染色液含有对人体有害的物质,室温下避光保存,且避免直接接触。
提示:本文件内容及相关参数如有变更,恕不另行通知。我公司保留在不另行通知的情况下,对其中所包含内容进行更改的权利。具体操作须以产品内说明书为准。
上一篇: