检测试剂
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【禽流感H7试剂】禽流感病毒H7亚型RT-PCR 检测试剂盒
禽流感病毒H7亚型RT-PCR 检测试剂盒
【产品名称】
通用名称：禽流感病毒H7亚型RT-PCR 检测试剂盒
英文名称：Avian Influenza Virus serotype H7（AIV-H7）RT-PCR Test Kit
【包装规格】10份/盒、40份/盒
【预期用途】
本试剂盒采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测禽组织、分泌物和排泄物中的AIV-H7，适用于AIV-H7的检测、诊断和流行病学调查。
【检测原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【主要组成成份】
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大盒
（室温保存）
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序号
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名称
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规格（10T/40T）
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序号
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名称
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规格（10T/40T）
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1
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裂解液
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8/30mL
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6
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吸附柱和收集管
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12/42套
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2
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BME
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85/400μL
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7
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0.2 mL 薄壁PCR 管
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15/50个
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3
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异丙醇
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8/30mL
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8
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50倍TAE电泳缓冲液
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20/50mL
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4
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洗涤液
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15/52mL
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9
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染色液
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20/40μL
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5
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洗脱液
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1mL/1mL×2
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小盒
（-20℃保存）
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10
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RT-PCR 反应液A
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220/362μL×2
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13
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阳性对照
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0.5/1mL
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11
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RT-PCR 反应液B
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16/52μL
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14
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阳性模板添加液
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5/10μL
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12
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阴性对照
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0.5/1mL
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【储存条件及有效期】
储存条件详见【主要组成成份】，本试剂盒有效期为6个月。
【适用仪器及材料】
1. 设备：分析天平、离心机（12000转/分钟）、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、-20℃冰箱。
2. 器材：眼科剪、眼科镊、组织研磨器（研钵或匀浆器）、一次性注射器、可调移液器（2.5μL、20μL、200 μL、1000 μL）、1000mL 量筒、250 mL锥形瓶、计时器。
3. 耗材及试剂：生理盐水、琼脂糖、DNA Marker、无RNA酶的1.5 mL离心管和吸头（10μL、200 μL、1000 μL）、灭菌蒸馏水。
【样品要求】
1.病死或扑杀的禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织。
2.待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于1mL 50%甘油生理盐水中。
3.新鲜样品立即检测或短期内2～8 ℃保存，避免反复冻融。
【检验方法】
样品制备
组织样品的处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
呼吸道分泌物或排泄物的处理：用涡旋振荡器振荡30s，取200μL上清于1.5mL灭菌离心管中。
阳性对照的处理：混匀后，取200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。
阴性对照的处理：混匀后，取200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 往裂解液中加入BME 77.6μL（10T）或291μL（40T），充分混匀。（加入了BME的裂解液须置于4℃保存）
2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600μL裂解液，上下颠倒混匀8～10次，室温静置10min 。
3. 加入600μL异丙醇，上下颠倒混匀5次。
4. 吸取650μL混合液转入吸附柱，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。
5. 重复步骤4。
6. 向吸附柱中加入600μL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。
7. 重复步骤6。
8. 空柱12,000 rpm 离心2 min。
9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入25μL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。立即检测或-20℃保存。
三、RT-PCR
1. 反应体系配制：每份总体积20 μL，分别取16.8μL RT-PCR反应液A（用前混匀）、1.2μL RT-PCR反应液B和2μL模板RNA（阳性对照管分别加入1μL模板RNA和1μL阳性模板添加液），混匀。最后加入20μL矿物油覆盖（有热盖的PCR仪不用加矿物油），作好标记。
2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 ℃ 45 min，95℃ 3 min ；循环95 ℃ 30 s 、55℃ 40 s 、72 ℃ 40 s ，共35次；72 ℃延伸10 min。
四、电泳
1. 量取20mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至1000mL。
2. 称取1.5g琼脂糖放于250mL的锥形瓶中，加入100mL稀释好的TAE电泳缓冲液，微波炉加热溶解，稍稍冷却后加入10μL染色液混匀，倒入插有梳子的制胶板中。
（注意：染色液如已成干粉，可用20μL（10T）或40μL（40T）稀释好的TAE电泳缓冲液复溶。）
3. 待胶凝固后，上样孔端放在电泳槽负极。取10μL PCR产物点样于上样孔中，同时点DNA Marker作为参照，以90～120V的电压于稀释好的TAE电泳缓冲液中电泳，待溴酚兰指示剂电泳至凝胶中下部时结束电泳，在紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）上观察结果。
【参考值】阳性对照出现640bp扩增带，阴性对照在目标位置无带出现时，实验结果成立。
【检验结果的解释】被检样品出现640bp扩增带为禽流感病毒H7亚型阳性，否则为阴性。
【检验方法的局限性】本试剂盒仅用于定性检测。
【注意事项】
1．各试剂须在规定的温度储存。
2．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期的试剂。
3. 严格遵守说明书操作，可以获得最好的实验结果，移液、定时等全部过程必须精确。
4．保存于-20℃的试剂使用前须完全融化，并充分混匀，8000rpm离心15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20℃。
5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度，建议3次内用完。
6．注意防止试剂盒组份受污染，不同试剂盒之间的组份不要混用。
7．RNA提取过程中，须戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间，避免RNA酶污染。
8. BME和染色液含有对人体有害的物质，室温下避光保存，且避免直接接触。
提示：本文件内容及相关参数如有变更，恕不另行通知。我公司保留在不另行通知的情况下，对其中所包含内容进行更改的权利。具体操作须以产品内说明书为准。
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