检测试剂
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【禽流感H7试剂】禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒
禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒
【产品名称】
通用名称：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒
英文名称：Avian Influenza Virus serotype H7（AIV-H7）real-time RT-PCR Test Kit
【包装规格】20份/盒
【预期用途】
禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，采用实时荧光反转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR ）技术检测禽组织、分泌物和排泄物中的AIV-H7，适用于AIV-H7的检测、诊断和流行病学调查。
【检测原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。经荧光素标记的探针与扩增的DNA杂交，利用DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号；利用荧光PCR仪检测特异性荧光信号，并根据样品Ct值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。
【主要组成成份】
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大盒
（室温保存）
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序号
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名称
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规格（20T）
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序号
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名称
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规格（20T）
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1
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裂解液
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15mL
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5
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洗脱液
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1mL
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2
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BME
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200μL
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6
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吸附柱和收集管
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22套
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3
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异丙醇
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15mL
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7
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8联PCR反应管
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3条
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4
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洗涤液
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30mL
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小盒
（-20℃保存）
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8
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RT-PCR 反应液A
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480μL
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10
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阴性对照
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1mL
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9
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RT-PCR 反应液B
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34μL
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11
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阳性对照
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1mL
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【储存条件及有效期】
储存条件详见【主要组成成份】，本试剂盒有效期为6个月。
【适用仪器及材料】
1. 设备：分析天平、离心机（12000转/分钟）、荧光PCR仪、-20℃冰箱。
2. 器材：眼科剪、眼科镊、组织研磨器（研钵或匀浆器）、一次性注射器、可调移液器（2.5μL、20μL、200 μL、1000 μL）、计时器。
3. 耗材及试剂：生理盐水、无RNA酶的1.5 mL离心管和吸头（10μL、200 μL、1000 μL）、灭菌蒸馏水。
【样品要求】
1.病死或扑杀的禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织。
2.待检活禽，用棉拭子取呼吸道或泄殖腔的分泌物或排泄物，置于1mL 50%甘油生理盐水中。
3.新鲜样品立即检测或短期内2～8 ℃保存，避免反复冻融。
【检验方法】
一、样品制备
1.组织样品的处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
2.分泌物或排泄物的处理：用涡旋振荡器振荡30s，取200μL上清于1.5mL灭菌离心管中。
3.阳性对照的处理：混匀后，8000 rpm离心2 min，取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管。
4.阴性对照的处理：混匀后取200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 往裂解液中加入BME 146μL，充分混匀。（加入了BME的裂解液须置于4℃保存）
2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600μL裂解液，上下颠倒混匀8～10次，室温静置10min 。
3. 加入600μL异丙醇，上下颠倒混匀5次。
4. 吸取650μL混合液转入吸附柱，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。
5. 重复步骤4。
6. 向吸附柱中加入600μL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。
7. 重复步骤6。
8. 空柱12,000 rpm 离心2 min。
9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入25μL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。立即检测或-20℃保存。
三、实时荧光RT-PCR
1. 反应体系配制：每份总体积25 µL，按下表配制，充分混匀，并作好标记。
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试剂
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用量
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RT-PCR反应液A
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21µL
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RT-PCR反应液B
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1.5µL
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模板RNA
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2.5µL
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2. 反应程序：在荧光 PCR 仪上进行以下反应：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3min；循环 95 ℃ 5 s，58℃ 40 s，共 40 次，在每次循环第二步（58℃ 40s）收集 FAM荧光信号（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）。
【参考值】阳性对照Ct 值≤30.0 且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值或Ct值=40时，实验成立。
【检验结果的解释】
1 结果分析条件设定
阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
2 结果描述及判定
当被检样品出现典型的扩增曲线且 Ct 值≤30.0 时为禽流感病毒H7亚型阳性，无 Ct 值为禽流感病毒H7亚型阴性；对于 Ct 值＞30.0 的样品，应重检，Ct 值＞38.0 的样品判为阴性，Ct 值≤38.0 的样品判为阳性。
【注意事项】
1．各试剂须在规定的温度储存。
2．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期的试剂。
3. 严格遵守说明书操作，可以获得最好的实验结果，移液、定时等全部过程必须精确。
4．保存于-20℃的试剂使用前须完全融化，并充分混匀，8000rpm离心15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20℃。
5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度，建议3次内用完。
6．注意防止试剂盒组份受污染，不同试剂盒之间的组份不要混用。
7．RNA提取过程中，须戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间，避免RNA酶污染。
8. BME含有对人体有害的物质，室温下避光保存，且避免直接接触。
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