检测试剂

伪狂犬试剂

    伪狂犬病(Pseudorabies,PR又名Aujeszky's disease,AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一种传染病。该病最早发现于美国,后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。20世纪中期,PR在东欧及巴尔干半岛的国家流行较广, 60年代之前,猪被感染后其症状比较温和,在养猪业中未造成重大经济损失。
    病原
    1.1 病原及其感染特点
    PRV属疱诊病毒科疱疹病毒甲亚科,暂定水痘病毒属,病毒粒子呈椭圆或圆形,无囊膜粒子直径为110-150nm;有囊膜的成熟病毒粒子直径180nm。囊膜表面有呈放射排列的纤突,长8-10nm,DNA分子量为87×l06。
    PRV是疱疹病毒中抵抗力较强的一种。在物体表面和液体中可存活7d。在pH4-9之间保持稳定。腐败条件下,病料中的病毒经lld失去感染力。PRV对乙醚、氯仿等脂溶剂,福尔马林和紫外线照射等敏感。5%石碳酸经2min灭活,0.5%-1%氢氧化钠使其灭活。对热的抵抗力较强,55-60℃经30-50min才能灭活,80℃经3min灭活。
    迄今为止,还没有发现抗原性不同的PRV毒株。在病毒与宿主的相互作用中,病毒的糖蛋白起着重要作用,现已发现在PRV至少有gⅠ、gⅡ、gⅢ、gp50、gp63、gX、gH、gL、gM、gN和gK等11种糖蛋白。
    1.2 感染特点
    1.2.1 潜伏感染 被感染猪不表现临床症状,但感染性病毒却能在猪体内长期以潜伏状态存在,也分离不到病毒,但用聚合酶探针方法可查出病毒基因组DNA的存在,在外界不良环境刺激等造成的免疫力减弱时,潜伏状态的病毒可转化为具有感染性的病毒。
    1.2 隐性感染 在猪群使用疫苗接种或自然感染部分少量病毒后,该猪只得到部分免疫,可发生隐性感染猪和表现为亚临床症状的猪,这种带毒猪排毒可持续一年以上。
    流行病学
    2.1 易感动物 PRV是感染动物种类多和致病性强的一种病毒。除各种年龄的猪、牛都易感外,在自然条件下使羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐等动物感染发病。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感。其中以家兔最敏感。
    2.2 传播形式
    2.2.1 垂直传播 PRV可通过胎盘而传递给子体,而母体免疫球蛋白却不能,所以对胎儿的感染是致命的。
    2.2.2 媒体传播 带有病毒的空气飞沫核可随风传到9km或更远的地方,使健康猪群受到感染。被污染的饲料、或带病毒的鼠、羊等动物也可传播。
    狗狗检测
    介绍
    狗传染性腹膜炎(FIP)是目前导致狗死亡的重要原因之一,从3个月到3龄狗以及大于10龄狗,特别是发生在那些纯种狗和其它数量及种类繁多但养在一起的家养狗。狗冠状病毒FeCV(Feline enteric Coronavirus)是高度传染性病毒而且偏好发生在数量及种类繁多而且养在一起的家养狗。FeCV给狗带来了极大的危险,FeCV阳性通常被认为是FIP的前奏。要控制狗FIP最根本的方法就是要做好FeCV的预防和控制。FeCV是广泛的狗冠状病毒Feline Coronavirus (FCoV)中的一种,FeCV抗体的存在仅表示有FeCV病毒存在和/或感染了FIP的可能性。对FeCV抗体呈阳性结果也不一定表示狗得到了FeCV病毒和/或感染了FIP,应该要和其它临床症状结合起来一齐判断。但阴性结果可说明没有FeCV病毒和/或感染了FIP。
    检测原理
    酶标板的孔中包被有纯化的冠状病毒抗原。从金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus提取的蛋白A与HRP结合成复合物。血清或血浆样品和蛋白A酶标记物一起在酶标板的孔中孵育。如果猫样品里存在FCoV抗体,抗体将与孔中的抗原结合,再与蛋白A酶标记物结合。多余的酶标记蛋白A被洗掉,加入发色底物。清晰的蓝色表示FCoV抗体存在,没有颜色变化表明没有FCoV抗体。
    该试剂盒具有高特异性和灵敏度,操作简单,30分钟内可以知道结果。试剂盒里包括阳性质控和阴性质控,仅需肉眼通过与阴性质控颜色进行比较,就可以准确地判断样品里FCoV抗体的存在。
    样品
    需1ul血清或血浆,只能检测猫的样品。样品可在2-8C保存7天,如果需要更长的保存,样品可保存在-20C。严重红细胞溶解或脂溶血会产生干扰的颜色,所以尽可能去得到更好质量的样品。
    准备洗涤液
    让洗涤浓缩液达到室温,轻轻地倒置混匀。用蒸馏水或去离子水稀释洗涤浓缩液(1份洗涤浓缩液加至9份水中),稀释后的洗涤液可保存于2-7C。
    结果
    a. 检测的有效性必须是:阳性质控孔里的液体呈清晰的蓝色,而阴性质控孔里的液体保持清澈。
    b. 假若样品孔的颜色变化比阴性质控孔深很多则表明,该动物以前或目前正受到FCoV感染,并且有可能通过排泄物传播病毒。此时便需要与其它的临床数据结合起来以确诊FIP。
    c. 如果样品孔里无颜色变化表明没有感染FIP疾病。
    试剂盒组份
    以下内容物包含在试剂盒里:
    包被好的酶标板 8x12孔
    阳性质控血清 1.5ml
    阴性质控血清 7.0ml
    蛋白A HRP标记物 5.0ml
    TMB 7.0ml
    底物缓冲液 7.0ml
    浓缩洗涤液 100.0ml
    注意事项
    * 试剂盒使用前恢复至室温(21-25C)
    * 不同样品使用不同的加样器头
    * 不要把试剂盒直接暴露在阳光下
    * 不要使用过期的试剂或不同试剂盒里试剂一齐混杂使用* 严格按照步骤操作,不适当的洗涤或试剂污染将产生非专一性的颜色* 仅限兽医使用保存和稳定性
将试剂盒和稀释的洗涤液保存于2-7C,不要冷冻。只要在适当保存条件下,试剂在有效期内是稳定的。
    临床症状
    病猪的临床症状和病程随年龄不同而有很大差异。哺乳仔猪最为敏感,15日龄以内的仔猪常表现为最急性型,病程不超过72h,死亡率100%,主要表现为体温升高、拉稀、发抖、运动不协调、流涎、颈部肌肉僵硬、四肢划水样运动,最后昏迷死亡。育肥猪则大多数伴有体温升高,呼吸困难,一般不发生死亡,耐过后呈长朗隐性感染带毒或排毒。成年猪常不呈现可见临床症状或仅表现为轻微体温升高,一般不发生死亡。母猪妊娠初期,可在感染后的20天左右发生流产,在妊娠后期,经常发生死胎和木乃伊,或者产出弱胎和死胎。
    猪伪狂犬病表现有四大症状:
    (1)妊娠母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎,其中以产死胎为主。
    (2)伪狂犬病引起新生仔猪大量死亡,主要表现在刚生下的仔猪第1天还很好,从第2天开始发病,3~5天内是死亡高峰期,有的整窝死亡。死亡初生仔猪的日龄已观察到19日龄。发病仔猪表现出高热、食欲废绝、明显的神经症状、昏睡、呜叫、流涎、呕吐、拉稀、抑郁震颤,继而出现运动失调、间歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡,一旦发病,1~2天内死亡。15日龄以内仔猪死亡率可高达100%。剖检主要是肾脏布满针尖样出血点,有时见到肺水肿、脑膜表面充血、出血。
    (3)伪狂犬病病毒引起断奶仔猪发病死亡,发病率在20%~40%,死亡率10%~20%,主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等。
    (4)种猪不育症。母猪不发情、配不上种,返情率高达90%,有反复配种数次都屡配不上,耽误了整个配种期。此外公猪感染伪狂犬病病毒后,表现不育、睾丸肿胀,萎缩,丧失种用能力。成年猪仅表现增重减慢等轻微温和症状。
    2.综合防制
    目前尚无治疗办法,但高免血清被动免疫适用于最初感染猪群中的哺乳仔猪,母猪的抗体通过初乳传给仔猪,母体源体可持续大约4~6周。母体被动免疫可以保护仔猪的致命感染。已发病或检查出伪狂犬病病毒感染阳性的猪场,建议所有的猪都应进行免疫。
    (1)灭活疫苗 种猪(包括公猪)第1次注射后,间隔4~6周后加强免疫一次,以后每6个月注射一次,产前一个月左右加强免疫一次,可获得非常好的免疫效果,能将哺乳仔猪保护到断奶。留作种用的断奶仔猪在断奶时注射一次,间隔4~6周后,加强免疫一次,以后按种猪免疫程序进行。育肥用的断奶仔猪在断奶时注射一次,直到出栏。
    (2)弱毒疫苗 种猪第1次注射后,间隔4~6周加强免疫一次,以后每隔4个月注射一次。育肥猪断奶时注射一次,直到出栏。
    诊断
    4.1 病毒分离和鉴定采取脑组织、扁桃体,用PBS制成10%悬液或鼻咽洗液接种猪、牛肾细胞或鸡胚成纤维细胞,于18-96h出现病变,有病变的细胞用H·E染色,镜检可看到嗜酸性核内包涵体。
    4.2 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin,取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔,通常在36-48h后注射部位出现剧痒,病兔啃咬注射部位皮肤,皮肤脱毛、破皮和出血,继之四肢麻痹,体温下降,卧地不起,最后角弓反张,抽搐死亡。
    4.3 血清学诊断
    4.3.1 中和试验(NT) NT有较高灵敏度,是一种常用的诊断方法。将标准病毒株与连续倍比稀释的等量血清混匀后,37℃中和lh,接种在96孔微量培养板上的单层猪肾继代细胞(PK-l5)或鸡胚成纤维细胞,置37℃,5%CO2培养观察CPE,以能完全中和试验病毒的血清最高稀释度的倒数为该血清的中和效价,中和效价大于或等于1:2的判为阳性。
    4.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)程由铨等应用单克隆抗体介导的固相微球直接ELISA检测感染,小白鼠额下腺、耳下腺混合物、肝、脾、肺、肾等材料,PRV的阳性检出率为98%。黄骏明等用过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A建立的Dot-ELISA对猪血清PRV抗体具有特异强、灵敏度高的优点,与血清中和试验比较,Dot-ELISA阳性检出率为28.19%(53/188)、NT阳性检出率为20.74%(39/188)。
    4.3.3 免疫荧光抗体试验(FA)程由铨等[10]建立了检测病料组织中PRV间接荧光抗体试验,并和病毒分离(VI)作了比较,对肺和扁桃体中PRV抗原检出率分别为FA86%和92%,V194%和88%。黄骏明等建立了直接FA技术检测PRV,对病猪活体取鼻咽试子涂片,对病死猪取扁桃体、三叉神经节、脑、脊髓和鼻粘膜涂片,检出率高达95%以上。
    4.3.4 核酸探针检测技术郭万栓等用斑点杂交法应用32P标记PRV全基因组DNA和重组质粒作探针检测细胞培养物中的PRV一DNA,均能检测lOpg的PRV一DNA,且有较高特异性。魏伟等用光敏生物素标记PRV特异性糖蛋白GP50克隆重组颗粒PUP作为探针,检测实验感染乳猪15头份,证明通过PCR和分子克隆技术制备的PRV特异性糖蛋白基因片段的光敏生物探针,能有效地用于检测伪狂犬病。
    4.3.5 PCR技术 冉多良等,石建平等,周复春等,冉智光等先后应用PCR技术对PRV进行基因扩增,均获得了特异敏感的结果。
    防治
    目前尚无治疗PR的有效药物。对PRV控制除常规隔离、消毒、控制人员流动以外,疫苗接种是防止PR发生流行的重要措施。Lens[3]报道用DNA重组技术研制的低毒力PR疫苗进行田间免疫,安全有效,应用该疫苗接种的猪再发生接独感染。目前国内主要应用灭活苗和弱毒苗预防PR,具有良好的免疫效果。灭活苗和弱毒苗只能降低接种猪的发病率和死亡率,但不能阻止带毒猪排毒。PR一旦传入猪场就很难根除,在发生过PR的猪场,停止使用疫苗后又会引起本病的发生。因此,在疫区进行疫苗接种外,非疫区应加强对引进猪的检疫,隔离饲养,搞好圈舍卫生,从而控制该病的发生和传播。

 
 

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