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【猪蓝耳试剂】猪蓝耳病通用型RT-PCR检测试剂盒

发布时间:2017-08-08 17:42:57 来源:猪蓝耳试剂 浏览次数:

 

猪蓝耳病通用型RT-PCR检测试剂盒
【产品名称】
通用名称:猪蓝耳病通用型RT-PCR检测试剂盒
英文名称:Common type Porcine reproductive and respiratory syndromePRRSRT-PCR Test Kit
【包装规格】10/盒、40/
【预期用途】
本试剂盒采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测猪血清和组织中的PRRSV,适用于PRRSV的检测、诊断和流行病学调查。
【检测原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板,在反转录酶的作用下,以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链;然后在DNA 聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环,使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后,在紫外灯下,肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【主要组成成份】
大盒
(室温保存)
序号
名称
规格(10T/40T
序号
名称
规格(10T/40T
1
裂解液
8/30mL
6
吸附柱和收集管
12/42
2
BME
85/400μL
7
0.2 mL 薄壁PCR
15/50
3
异丙醇
8/30mL
8
50TAE电泳缓冲液
20/50mL
4
洗涤液
15/52mL
9
染色液
20/40μL
5
洗脱液
1mL/1mL×2
 
 
 
小盒
-20℃保存)
10
RT-PCR 反应液A
220/362μL×2
12
阴性对照
0.5/1mL
11
RT-PCR 反应液B
16/52μL
13
阳性对照
0.5/1mL
【储存条件及有效期】
储存条件详见【主要组成成份】,本试剂盒有效期为6个月。
【适用仪器及材料】
1. 设备:分析天平、离心机(12000/分钟)、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、-20℃冰箱。
2. 器材:眼科剪、眼科镊、组织研磨器(研钵或匀浆器)、一次性注射器、可调移液器(2.5μL20μL200 μL1000 μL)、1000mL 量筒、250 mL锥形瓶、计时器。
3. 耗材及试剂:生理盐水、琼脂糖、DNA Marker、无RNA酶的1.5 mL离心管和吸头(10μL200 μL1000 μL)、灭菌蒸馏水。
【样品要求】
病死或扑杀的猪,取肺、扁桃体和脑等组织。
待检活猪,用注射器取血5 mL
新鲜样品立即检测或短期内28 ℃保存,避免反复冻融。
【检验方法】
一、样品制备
组织样品的处理:每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g,用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
全血样品的处理:待血凝后取200 μL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。
阳性对照的处理:混匀后,8000rpm离心2min,取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。
阴性对照的处理:取200 μL1.5 mL 灭菌离心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 往裂解液中加入BME 77.6μL10T)或291μL40T),充分混匀。(加入了BME的裂解液须置于4℃保存)
2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入600μL裂解液,上下颠倒混匀810次,室温静置10min
3. 加入600μL异丙醇,上下颠倒混匀5次。
4. 吸取650μL混合液转入吸附柱,12,000 rpm 离心45s,弃去收集管中液体,套回收集管。
5. 重复步骤4
6. 向吸附柱中加入600μL洗涤液,12,000 rpm 离心45s,弃去收集管中液体,套回收集管。
7. 重复步骤6
8. 空柱12,000 rpm 离心2 min
9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中,在吸附柱膜中央加入25μL洗脱液,室温静置1min12,000 rpm 离心45s,获得总RNA。立即检测或-20℃保存。
三、RT-PCR
1. 反应体系配制:每份总体积20 μL,分别取16.8μL RT-PCR反应液A(用前混匀)、1.2μL RT-PCR反应液B2μL模板RNA,混匀。最后加入20μL矿物油覆盖(有热盖的PCR仪不用加矿物油),作好标记。
2. 反应程序:在PCR仪上运行以下程序: 42 ℃ 45 min94 ℃ 3 min ;循环94 ℃ 30 s 53℃ 30 s 72 ℃ 30 s,共35次;72 ℃延伸10 min
四、电泳
1. 量取20mL 50TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至1000mL
2. 称取1.5g琼脂糖放于250mL的锥形瓶中,加入100mL稀释好的TAE电泳缓冲液,微波炉加热溶解,稍稍冷却后加入10μL染色液混匀,倒入插有梳子的制胶板中。
(注意:染色液如已成干粉,可用20μL10T)或40μL40T)稀释好的TAE电泳缓冲液复溶。)
3. 待胶凝固后,上样孔端放在电泳槽负极。取10μL PCR产物点样于上样孔中,同时点DNA Marker作为参照,以90120V的电压于稀释好的TAE电泳缓冲液中电泳,待溴酚兰指示剂电泳至凝胶中下部时结束电泳,在紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)上观察结果。
【参考值】阳性对照出现492bp扩增带,阴性对照在目标位置无带出现时,实验结果成立。
【检验结果的解释】被检样品出现492bp扩增带为猪蓝耳病阳性,否则为阴性。
【检验方法的局限性】本试剂盒仅用于定性检测。
【注意事项】
1.各试剂须在规定的温度储存。
2.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期的试剂。
3. 严格遵守说明书操作,可以获得最好的实验结果,移液、定时等全部过程必须精确。
4.保存于-20℃的试剂使用前须完全融化,并充分混匀,8000rpm离心15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取,使用后立即放回-20℃
5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度,建议3次内用完。
6.注意防止试剂盒组份受污染,不同试剂盒之间的组份不要混用。
7RNA提取过程中,须戴口罩、勤换手套,尽量缩短操作时间,避免RNA酶污染。
8. BME和染色液含有对人体有害的物质,室温下避光保存,且避免直接接触。
 
 
提示:本文件内容及相关参数如有变更,恕不另行通知。我公司保留在不另行通知的情况下,对其中所包含内容进行更改的权利。具体操作须以产品内说明书为准。
 

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